真核細胞的復雜生命活動不僅有賴于多種細胞器之間的精密協(xié)同作用，而且是各種生化參數(shù)精確調(diào)控的結(jié)果，因而具有高度的時間和空間動態(tài)特性。因此對活細胞生理過程的觀測不僅需要多目標高速成像的能力，還要求能夠?qū)毎麅?nèi)特定物化參數(shù)進行定量探測。

熒光顯微成像技術(shù)由于其特異性的標記能力以及與活體細胞的兼容性在細胞生理活動探測中廣受青睞。然而分子熒光的光譜帶寬較大（>50 nm），因此在可見光范圍內(nèi)多色熒光顯微成像的目標一般于3~4個，難以滿足對活細胞復雜過程的觀測需求。另一方面，熒光生物傳感探測分子(biosensor)是實現(xiàn)對細胞內(nèi)特定生化參數(shù)測量的主要工具。其定量測量大多依賴于探測復雜的光譜變化，所以這種定量成像與多色成像的結(jié)合對于現(xiàn)有的熒光顯微技術(shù)是一大挑戰(zhàn)。

光譜成像技術(shù)提供了解決以上問題的潛在途徑。但是一般基于熒光發(fā)射光譜的光譜成像技術(shù)往往有賴于逐點掃描來積累不同空間位置的光譜信息，因而不能滿足高速成像的需求。相比之下，熒光激發(fā)光譜可實現(xiàn)對寬場成像（wide-field imaging）的快速掃描，從而大大提高光譜顯微成像的速度。不過，相關(guān)研究尚不成熟，有較大局限性。

近日，加州大學伯克利分?；瘜W學院的許可教授團隊開發(fā)出了一種熒光激發(fā)光譜顯微成像系統(tǒng)，實現(xiàn)了活細胞內(nèi)多達六種細胞結(jié)構(gòu)的同步動態(tài)觀測，且不同成像目標間的顏色串擾低于2%；更重要的是，該技術(shù)實現(xiàn)了多目標成像與定量生物傳感測量的結(jié)合，揭示了線粒體自噬過程中的多細胞器相互作用以及線粒體pH定量變化模型。

該光學成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究人員使用具有寬帶光譜的高功率等離子光源，利用聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF）對激發(fā)波長進行高速掃描，實現(xiàn)了與相機幀率同步的不同波長循環(huán)激發(fā)。

圖1. 激發(fā)光譜顯微成像系統(tǒng)及其對活細胞內(nèi)六種結(jié)構(gòu)的同時成像表征

這一設(shè)計提供了對激發(fā)波長的靈活選擇性，研究人員從而采用光譜顯著重疊的六種熒光小分子或者基因編碼表達的熒光蛋白對活細胞內(nèi)進行標記（包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、DNA、脂肪小滴和細胞膜在內(nèi)的六種目標），實現(xiàn)了同步、長時程動態(tài)觀測，且不同目標間的顏色串擾僅為1.3%。此外，研究人員還實現(xiàn)了時間分辨率達到約10毫秒的多目標成像，其成像速度僅受限于相機的幀率。

在此基礎(chǔ)上，研究人員揭示了一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的脂肪小滴的新融合機制（圖2）。

圖2. 高速激發(fā)光譜成像揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（黃色）介導的脂肪小滴（紫色）的快速融合過程

除了多目標成像之外，研究人員還將此成像系統(tǒng)擴展至生物傳感，進而實現(xiàn)對活細胞內(nèi)特定參數(shù)的高時空分辨率的定量觀測。研究人員選擇了具有二重態(tài)激發(fā)光譜的pH值探測熒光蛋白（pHRed）和基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）的大分子擁擠程度（macromolecular crowding）探測熒光蛋白對。通過對其局域激發(fā)光譜的線性解析，分別得到了線粒體基質(zhì)的pH值，以及細胞質(zhì)內(nèi)的大分子擁擠程度在二維空間的分布圖。

通過長時程、高時空分辨率的觀測，成功揭示了線粒體基質(zhì)pH突升和線粒體的形態(tài)變化的同步關(guān)系，以及活細胞內(nèi)細胞質(zhì)和細胞核對外界的高滲透壓和低滲透壓作用的不同反應(yīng)模式（圖3）。

圖3. 基于激發(fā)光譜的活細胞pH值（左）和擁擠程度（crowding；右）的定量顯微成像

光譜成像的另一個挑戰(zhàn)是結(jié)合多目標成像與定量生物傳感探測。研究人員利用激發(fā)光譜成像解析了線粒體自噬（mitophagy）過程中多個關(guān)鍵細胞器和蛋白（包括線粒體、自噬體、溶酶體和Parkin蛋白）的動態(tài)特性，同時監(jiān)測了線粒體基質(zhì)的pH值在自噬過程中的定量變化。這一成像結(jié)果揭示了在Parkin/Pink1介導的線粒體自噬過程中不同細胞器的復雜的動態(tài)相互作用，以及線粒體pH值在這一路徑中逐漸降低的變化趨勢。

圖4. 激發(fā)光譜成像同時實現(xiàn)活細胞內(nèi)線粒體自噬過程中的多目標成像和pH探測

總體而言，基于熒光激發(fā)光譜的顯微成像技術(shù)獨到地結(jié)合了寬場成像的優(yōu)勢，具有優(yōu)異的時空分辨能力；其通過光譜線性解析定量區(qū)分不同成分的能力不僅實現(xiàn)了多目標的高速成像探測，同時也能結(jié)合各種生物傳感分子實現(xiàn)生化參數(shù)的定量成像表征。在后續(xù)工作中課題組可望結(jié)合光片照明技術(shù)（light-sheet illumination）將這種定量多目標成像擴展到三維空間；或者應(yīng)用結(jié)構(gòu)光照明，實現(xiàn)超分辨定量成像。另一個潛在發(fā)展方向是開發(fā)其他具有光譜特異性的生物探針，從而結(jié)合激發(fā)光譜成像以實現(xiàn)對活體細胞內(nèi)多種結(jié)構(gòu)和功能的定量探測。